Obiectivele proiectului ANTIOX:

• Monitorizarea modificarilor induse de flavonoide in parametrii electrici ai bistraturilor lipidice

Pornind de la ideea ca metalele grele genereaza aparitia de radicali liberi la nivelul bistratului lipidic si quercetina se insereaza in membrana celulara, in proiectul de fata dorim sa investigam efectul quercetinei prin monitorizarea parametrilor electrici ai bistraturilor lipidice artificiale in prezenta metalelor grele, utilizand tehnica BLM (Black Lipid Membrane). Modificarea conductantei si capacitatii bistratului lipidic ar putea contribui la obtinerea unor informatii valoroase referitoare la modul in care ionii metalelor grele interactioneaza cu faza lipidica si a modului in care Que influenteaza aceasta interactie, informatii care ar putea fi relevante pentru intelegerea mecanismelor proceselor care se desfasoara in vivo. De asemenea, se vor urmari efectele EGCG asupra bistraturilor lipidice artificiale planare, intrucat asemenea date nu au fost raportate pana in prezent in literatura de specialitate.

• Elucidarea influentei flavonoidelor Que si EGCG asupra fluiditatii membranelor leucocitelor mononucleare

Pornind de la date din literatura privind modificarea fluiditatii si permeabilitatii membranelor liposomale de catre bioflavonoide si valorificand experienta noastra in determinarea fluiditatii membranelor limfocitelor si plachetelor umane (Katona et al. 2003, 2004), ne propunem sa evidentiem - prin masuratori de anizotropie de fluorescenta (fluorofori: DPH si TMA DPH) - modificarile induse de Que si EGCG in parametrul de ordine al lipidelor in diferite regiuni ale bistratului membranelor celulelor mononucleare separate din sange periferic uman recoltat de la subiecti sanatosi clinic, respectiv bolnavi de diabet, in conditii normale si in conditii de stress provocat prin schimbarea compozitiei mediului de suspensie.

• Studiul efectelor unor flavonoide asupra receptorului nicotinic (nAChR)

Mecanismele prin care flavonoidele naturale interfera cu patogenia bolilor neurologice nu sunt elucidate pe deplin in acest moment, existand insa date care sugereaza, pe langa neuroprotectie nespecifica, interferenta cu cai nicotinergice de transmisie a informatiei in sistemul nervos central. Date preliminare obtinute de noi (Popescu et al, 2005), referitoare la quercetina, indica o posibila interferenta a acesteia cu mecanismele de desensibilizare a nAChR, prin modificarea cineticii de deschidere-inchidere a receptorului. Proiectul nostru isi propune studiul efectelor directe ale EGCG si Que asupra nAChR, exprimat in linia celulara TE671LH, prin metode electrofiziologice (patch-clamp). Pana in prezent nu exista in literatura date raportate asupra acestor efecte. Se vor urmari: efectele directe (imediate) ale EGCG si Que asupra nAChR (amplitudinea curentilor prin receptor, cinetica de activare a receptorului) efectele celor doua flavonoide asupra desensibilizarii receptorului efectele celor doua flavonoide asupra permeabilitatii membranare (modificari ale conductantei membranare la diferite specii ionice).

• Investigarea efectelor unor flavonoide asupra canalului epitelial de Na⁺ sensibil la amilorida

Ne propunem sa investigam efectul Que si al EGCG asupra transportului de Na⁺ din epitelii A6 in prezenta si in absenta cadmiului utilizand tehnicile de scurt circuit si analiza de zgomot. Avand in vedere competitia dintre unele metale grele si amilorida ne propunem sa investigam cinetica acestui inhibitor in prezenta flavonoidelor si/sau a cadmiului prin analiza de zgomot. Prin exprimarea ENaC in oocite de X. laevis dorim sa investigam efectul direct al celor doua flavonoide asupra canalului de Na⁺ in absenta altor proteine transportoare sau citoplasmatice si la diferite tensiuni electrice membranare.

• Evidentierea efectelelor EGCG si Que asupra unor mecanisme de semnalizare intracelulara

Pornind de la date publicate care indica afectarea semnalizarii intracelulare ca posibil mecanism de actiune a flavonoidelor si valorificand experienta noastra anterioara in utilizarea tehnicilor de electroforeza SDS-PAGE-analiza Western blotting vizualizata prin chemiluminescenta amplificata, precum si in masurarea semnalelor de calciu celular (Katona et al, 2003, 2005) ne propunem sa investigam modul in care flavonoidele (EGCG) influenteaza nivelul de fosforilare/activare al unor factori de transcriptie (cFos, CREB) si enzime cheie din reteaua de semnalizare intracelulara (ERK, JNK, p38), respectiv nivelele si semnalul de calciu si nivelul speciilor active de oxigen (ROS) in celule sanguine mononucleare umane, in conditii normale si de stress.

• Modelarea efectului quercetinei asupra canalelor de calciu din reticului endoplasmic

Pornind de la un model anterior al nostru pentru receptorul de IP3, similar structural si functional receptorului de Ca din reticulul sarcoplasmatic, vom realiza un model al acestui receptor, din care vom obtine informatii cu privire la: mecanismele activitatii canalului, reglarea alosterica a legarii Ca²⁺ si Que, ratele tranzitiilor intre diferitele stari, afinitatile liganzilor si coeficientii Hill care caracterizeaza legarea ionilor Ca²⁺ si a quercetinei la receptor. Mecanismul fundamental propus este modularea alosterica a capacitatii de legare a ionului Ca²⁺ la receptor de catre alti liganzi, in cazul de fata quercetina.

• Investigarea efectelelor EGCG si Que asupra viabilitatii / proliferarii si modalitatilor de supravietuire / moarte celulara

Avand in vedere datele din literatura care releva atat efecte antiproliferative, cat si efecte protectoare, antinecrotice miogenetice ale flavonoidelor si bazandu-ne pe experienta anterioara in detectarea modificarilor induse de factori fizico-chimici in viabilitatea / proliferarea celulelor mononucleare umane (Katona et al. 2003, 2005; seremet et al 2005) ne propunem sa urmarim modul in care flavonoidele naturale EGCG si Que influenteaza procesele de supravietuire / proliferare si ponderea diferitelor forme de moarte celulara. Se vor corela date de microscopie in contrast de faza, de fluorescenta si confocala cu date de citometrie in flux privind modificarile induse de EGCG si Que in  viabilitatea celulara,  proliferarea celulara,  marimea subpopulatiilor de celule vii/apoptotice timpurii /apoptotice tarzii / necrotice,  ciclul celular,  starea membranelor mitocondriale,  distributia si volumul retelei mitocondriale si  starea redox a celulelor

• Studiul efectelor unor flavonoide asupra celulelor de drojdie, in conditii de stress

Efectul antioxidant al quercetinei si EGCG asupra celulelor de drojdie, S. cerevisiae wild-type, va fi studiat in conditii normale si de stress (tratament cu nocodazol). in experimentele cu nocodazol se vor determina: supravietuirea celulara, sincronizarea celulelor in G2/M, cresterea celulelor in cultura, precum si spectrele DL in prezenta/absenta flavonoidelor si nocodazolului. Se vor determina efectele acestor antioxidanti asupra depolimerizarii microtubulilor indusa de nocodazol. De asemenea, se vor estima efectele Que si EGCG asupra spectrului DL al celulelor cu microtubuli integrali sau dizolvati. Se va realiza acelasi tip de masuratori DL atat in culturile tratate cat si in cele netratate cu flavonoide. Este de mentionat ca aceste subiecte nu au mai fost investigate. Se vor obtine informatii noi cu privire la originea luminescentei intarziate si la relatia acesteia cu radicalii liberi si citoscheletul.