Prezentarea stiintifica si tehnica a programului ANTIOX:

1. Gradul de noutate si complexitate

    Abordarea complexa, multidisciplinara a elucidarii efectelor celulare/subcelulare ale flavonoidelor naturale EGCG si Que pe care proiectul nostru o propune, reprezinta o premiera pe plan national. Studiul tinteste identificarea si caracterizarea unor modificari de structura/functie celulara/subcelulara, induse de EGCG si Que, importante in determinarea efectelor lor benefice, precum si determinarea domeniilor de concentratii necesare inducerii acestor efecte in conditii normale si in conditii de stress.     Utilizand variate tehnici biofizice/biochimice avansate (BLM, patch clamp, analiza de zgomot, separare si analiza de proteine prin SDS-PAGE - Western blotting - chemiluminescenta amplificata, metode fluorimetrice, citometrie in flux, microscopie confocala, analiza de imagine, etc) si metode de modelare matematica in scopul evidentierii / cuantificarii / explicarii efectelor induse in diferite structuri membranare (artificiale / naturale) / structuri subcelulare (BLM, diverse regiuni ale membranei plasmatice, complexe proteice membranare functionale: receptori (nAChR, IP3R) si canale (ENaC), distributie si volum al retelei mitocondriale, etc)  in mecanisme implicate in semnalizarea intracelulara (fosforilare/activare de enzime si factori de transcriptie, semnal de calciu, nivel ROS), precum si  in starea globala / soarta celulei (stare redox, viabilitate / proliferare, supravietuire/moarte celulara, ponderea diferitelor forme de moarte celulara), sporul de cunostinte preconizat este substantial. Realizarea acestor obiective complexe implica cooperarea multidisciplinara dintre biofizicieni, biochimisti, biologi, medici, fizicieni teoreticieni, precum si cooperare interinstitutionala si internationala.

2. Metodologia si tehnicile care vor fi utilizate, instrumente, echipamente, software, contributia fiecarui partener

• A) Monitorizarea modificarilor induse de flavonoide in parametrii electrici ai bistraturilor lipidice (P1-CO)

      Efectul quercetinei si EGCG asupra bistraturilor lipidice artificiale va fi studiat prin metoda BLM. Se vor urmari variatiile parametrilor electrici (conductanta, capacitate) ai membranelor astfel obtinute, in prezenta unor metale grele, si in prezenta sau absenta flavonoidelor atasate/inserate in bistratul lipidic, utilizand o instalatie BLM pusa la punct in laboratoarele P1-CO in cadrul unor proiecte de cercetare anterioare si software PCLab 2000, ver. Velleman 1.30.

• B) Elucidarea influentei flavonoidelor Que si EGCG asupra fluiditatii membranelor leucocitelor mononucleare (P1-CO)

Modificarile induse de Que si EGCG in parametrul de ordine al lipidelor in diferite regiuni ale bistratului membranelor celulelor mononucleare separate din sange periferic uman recoltat de la subiecti sanatosi clinic, respectiv bolnavi de diabet, in conditii normale si in conditii de stress vor fi evidentiate prin masuratori de anizotropie de fluorescenta (fluorofori: DPH si TMA DPH), utilizand un spectrofluorimetru Jobin-Yvon JY3 conectat la calculator si software Easyest, aflat in dotarea catedrei de Biofizica a P1-CO sau/si un spectrofluorimetru Perkin Elmer LS50B cu software dedicat, aflat in dotarea catedrei de Biochimie de la Facultatea de Farmacie a P1-CO, precum si protocoale de achizitie si prelucrare de date puse la punct in cadrul unor proiecte anterioare (Katona et al 2003)

• C) Studiul efectelor unor flavonoide asupra nAChR (P1-CO in cooperare cu U.N. Lisabona)

Vor fi investigate mecanismele de actiune ale EGCG si Que din punct de vedere electrofiziologic. Secundar, se vor face masuratori privind modificarea permeabilitatii membranelor celulare sub actiunea celor doua flavonoide. Experimentele vor fi efectuate in colaborare cu Universitatea Noua din Lisabona. Studiul va fi efectuat pe linia celulara TE671LH, care exprima nativ receptorul nicotinic. Se vor efectua masuratori prin tehnica patch-clamp, urmarindu-se urmatorii parametri: amplitudinea curentilor nicotinici tranzitorii la aplicarea de EGCG; respectiv de Que, cinetica de deschidere si de inchidere a nAChR sub actiunea EGCG si Que, efectul cumulat al celor doua substante asupra acelorasi parametri, efectul EGCG si Que asupra desensibilizarii receptorului nicotinic, modificarea permeabilitatii stationare a membranei celulare pentru anumite specii ionice ca efect al aplicarii EGCG si quercetinei.

• D) Investigarea efectelor unor flavonoide asupra ENaC sensibil la amilorida (P1-CO, P3)

      Vom aplica metoda de scurt-circuit si metoda analizei de zgomot pentru studiul influentei quercetinei asupra transportului de sodiu transmembranar prin canale ENaC exprimate de epitelii A6, in prezenta si absenta ionului de cadmiu. Prin expresia ENaC pe oocite de Xenopus laevis vom studia, prin tehnica potentialului fixat cu doi electrozi (TEVC), efectul direct al Que si EGCG asupra ENaC, in absenta altor proteine membranare sau citoplasmatice care pot interfera cu actiunea flavonoidelor, si pentru diferite valori ale potentialului de membrana.

• E) Evidentierea efectelelor EGCG si Que asupra unor mecanisme de semnalizare intracelulara (P1-CO, P2 )

. Se vor intreprinde studii pe suspensii celulare mentinute in cultura in prezenta/lipsa flavonoidelor, Vom aplica  tehnici de electroforeza -analiza Western blotting cu detectie prin chemiluminescenta amplificata (CLA) - utilizand echipamente achizitionate (aparate de electroforeza MiniProtean si MiniGel BioRad, Mighty Small, Hoefer, aparat de blotare Sammy Dry, Schleicher & Schuell, sursa ISCO model 595), reteta de reactivi pt. detectie prin CLA (Marzluff Lab Protocols, http://www.unc.edu/depts/marzluff/protocols/protocols.html) asimilata, procedee si protocoale de lucru puse la punct si perfectionate in laboratoarele de biochimie a P1-CO in cadrul unor proiecte de cercetare anterioare - in vederea investigarii modului in care flavonoidele (EGCG) influenteaza nivelul de fosforilare/activare al unor factori de transcriptie (cFos, CREB) si enzime cheie din reteaua de semnalizare intracelulara (ERK, JNK, p38),  tehnici de fluorimetrie stationara - utilizand in studii pe suspensii celulare Fura-2 drept fluorofor, precum si procedeu de calibrare si protocoale de masurare elaborate si spectrofluorimetru Perkin-Elmer LS55 cu soft dedicat, achizitionat de P1-CO in cadrul unor proiecte anterioare utilizand - in vederea investigarii influentei flavonoidelor asupra nivelelelor si semnalului de calciu,   tehnici de microscopie confocala - utilizand un microscop Nikon Eclipse T300 cu modul Confocal PCM2000, aflat in dotarea P2 si Fluo3 si Rhod2 drept fluorofori - in vederea vizualizarii simultane a nivelelor de calciu citoplasmatic si mitocondrial si   tehnici de citometrie in flux - utilizand un citometru in flux Becton Dickinson FACS Calibur cu soft de achizitie CellQuest, aflat in dotarea P2 - in vederea detectarii modificarilor induse de EGCG in nivelul speciilor active de oxigen (ROS) in celule sanguine mononucleare umane, in conditii normale si de stress.

• F) Modelarea efectului Que asupra canalelor de Ca²⁺ din ER (P1-CO, P4 )

Vor fi analizate date experimentale existente in literatura de specialitate (Lee et al., 2002) si se va adapta un model anterior (Baran 2003, 2005) pentru receptorul de inositol 1,3,5-trifosfat (IP₃R), care este canalul de calciu al reticulului endoplasmic. Mecanismul fundamental propus este modularea alosterica a capacitatii de legare a ionului Ca²⁺ la receptor de catre alti liganzi, in cazul de fata Que. Calculul probabilitatii de deschidere si a timpilor de deschidere si inchidere se face conform unei metode publicate anterior (Baran 2003, 2005). Folosind modelul intr-o forma adaptata pentru receptorul rianodinei, se vor obtine informatii deosebit de utile cu privire la: mecanismele activitatii canalului, reglarea alosterica a legarii Ca²⁺ si Que, ratele tranzitiilor intre diferitele stari, afinitatile liganzilor si coeficientii Hill care caracterizeaza legarea ionilor Ca²⁺ si a Que la receptor.

• G) Investigarea efectelelor EGCG si Que asupra viabilitatii / proliferarii si modalitatilor de supravietuire / moarte celulara

Modificarile induse de EGCG si Que in (i) viabilitatea celulara, (ii) rata de celule vii / apoptotice / necrotice, (iii) starea membranelor mitocondriale, (iv) marimea subpopulatiilor de celule vii/apoptotice timpurii /apoptotice tarzii / necrotice, (v) ciclul celular, (vi) distributia si volumul retelei mitocondriale si (vii) starea redox a celulelor vor fi urmarite prin  microscopie optica conventionala (i) (metoda excluderii albastrului de tripan),  microscopie de contrast de faza (i), (ii) si (iv),  microscopie de fluorescenta (ii) si (iv) (fluorofori: Hoechst si PI), utilizand un microscop de fluorescenta Zeiss Axiovert 25 CFL inversat aflat in dotarea catedrei de Biochimie a P1-CO, precum si prin  citometrie in flux (ii), (iii), (iv) si (v) (folosind marcarea simpla cu JC-1 (iii), marcare dubla cu AnnexinaV FITC si iodura de propidiu(PI) / 7 AAD (iv) si marcare simpla cu PI (v)), utilizand citometrul in flux Becton Dickinson FACSCalibur cu soft de achizitie CellQuest, aflat in dotarea P2 si prin  microscopie confocala (vi) si (vii) (marcare cu MitoTracker si analiza de imagine (vii) respectiv marcare cu RedoxSensorRed (vii)) utilizand microscopul Nikon Eclipse T300 cu modul Confocal PCM2000, aflat in dotarea P2.

• H) Studiul efectului EGCG-Que asupra S.cerevisiae, in conditii de stress (P1-CO , P4 )

        Efectele nocodazolului asupra caracteristicilor luminescentei intarziate (DL) vor fi evidentiate prin modificarile produsului total al emisiei luminii si ale cineticii de emisie. Se va determina cum se modifica numarul de stari excitate care emit lumina cu diferite lungimi de unda (in urma excitarii laser) si proportia starilor excitate care emit cu probabilitate mare, rezultand informatii cu privire la modificarile moleculare induse de nocodazol si efectul Que si EGCG asupra acestora. Efectele biologice vor fi corelate cu variatiile observate in proprietatile luminiscentei intarziate a celulelor de drojdie in suspensie, masurate cu un dispozitiv experimental extrem de complex si performant, disponibil la Institutul National de Fizica Nucleara, Laboratori Nazionali del Sud, Catania, din Italia. Proba biologica este excitata cu lumina laser, iar fotonii emisi de sistem sunt detectati cu un tub fotomultiplicator setat pe numarare de fotonii singulari. Se va masura atat intensitatea maxima a luminii emise, cat si cinetica emisiei de fotoni. Aceste stari sunt influentate de starea celulara, de aceea furnizeaza informatii biologice utile.